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    EGY48

    文字:[大][中][小] 2015-8-27    瀏覽次數:5406    

    EGY48  Chemically Competent Cell 產品說明書




    產品規格 (CAT#: YC1030)

    EGY48 Competent Cell:                                       100μl/支              保存: -80℃(3個月)

    pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12個月)

    Carrier DNA (5 μg/μl)                                              100μl              保存:-20℃(12個月)

    PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12個月)



    基因型

    MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2


    產品說明

    EGY48菌株是Clontech公司開發的LexA系統酵母雙雜實驗用菌株,MATα型,可直接轉化質粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗;Transformation marker為:his3,trp1,ura3,報告基因為:LEU2;報告基因UAS (上游激活序列)來源于LexA op(x6),只有當 Bait和 Prey互作時才能啟動 LEU2表達。EGY48-LexA酵母雙雜系統系統需要三種質粒配套使用:pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。質粒pLexA的篩選標志為HIS3,用于表達DNA-BD(來自原核的202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標蛋白 (Bait)的融合蛋白;質粒pB42AD的篩選標志為TRP1,用于表達AD(來自皰疹病毒的88個氨基酸殘基組成的B42AD蛋白)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白;報告質粒p8op-LacZ的篩選標志為URA3,報告基因為LacZ,報告基因UAS來源于LexA op(x6),只有當 Bait和 Prey互作時才能啟動 LacZ表達。EGY48感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGBKT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。


    操作方法
    1. 取100 μl冰上融化的EGY48感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒2-5ug,Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴,重復一次)10 ul ,PEG/LiAc  500ul并吸打幾次混勻,30度水浴30 分鐘(15 min時翻轉6-8次混勻)。
    2. 將管放42度水浴15min  (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。   
    3. 5000 rpm 離心 40s 棄上清,ddH2O 400ul 重懸,離心 30s 棄上清。                       

    4. ddH2O 50ul重懸,涂板,29℃培養48-96h。


    注意事項

    1. 感受態細胞最好在冰上融化。

    2. 轉化高濃度的質??上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

    3. 同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

    4. EGY48酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。

    5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

    6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養可見直徑1 mm克??;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培養可見直徑1 mm克隆。


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